Im Rahmen des Biologieunterrichts besuchte die 13. Klasse am 28.11.2024 das Gläserne Labor in Berlin Buch. Dort nahmen die Schülerinnen und Schüler an einem vierstündigen Laborkurs teil, welcher sich mit dem Thema „Klonierung – Restriktionsenzyme und Transformation“ beschäftigte. Ziel war es, Bakterien in ihrem genetischen Aufbau so zu modifizieren, dass diese durch Anstrahlen mit UV-Licht leuchten.
Dazu wurde das Gen für ein ursprünglich in einer Quallenart zu findendes grün fluoreszierendes Protein (GFP-Gen) in ein Plasmid eingeführt. Mithilfe zweier Restriktionsenzyme, die die ringförmige Plasmid-DNA an jeweils einer Stelle schneiden, wurde zunächst getestet, ob der Einbau des GFP-Gens erfolgreich war. Dabei wurde in drei Versuchsansätzen Plasmid-DNA zu Pufferlösungen mit jeweils einem oder beiden Enzymen gegeben. Anschließend wurden die Lösungen zum Sammeln der Flüssigkeit am Gefäßboden zentrifugiert und dann in einen Heizblock gestellt, so dass die Restriktionsenzyme das Plasmid bei einer für sie optimalen Temperatur schneiden konnten. Im nächsten Schritt wurde mithilfe einer Agarose-Gelelektrophorese durch Auftrennung der beim Verdau entstandenen DNA-Stücke nach Größe und Ladung in einem elektrischen Feld überprüft, ob das Plasmid geschnitten wurde und das GFP-Gen tatsächlich im Plasmid enthalten ist. Dazu wurde ein Probenpuffer zu den Versuchsansätzen gegeben, um die Flüssigkeiten zu erschweren und zu färben, damit diese besser in die Taschen des Agarosegels sinken und einfacher zu erkennen sind. Nach der Gelelektrophorese sah man die Längen der jeweiligen DNA-Stücke in den Ansätzen. Es war zu erkennen, dass die Lösung, die beide Enzyme enthielt, erwartungsgemäß zwei Banden im Agarosegel vorzuweisen hatte. Durch einen Größenvergleich mit DNA-Stücken bekannter Längen konnte nachgewiesen werden, dass das GFP-Gen erfolgreich in das Plasmid eingefügt wurde.
Als Nächstes wurden die Plasmide durch Transformation in kompetente Bakterien eingeschleust. Dazu wurden Bakterien von einer Starterplatte entnommen und in zwei Ansätze mit Transformationslösung gegeben. Daraufhin wurde das Plasmid in eines der beiden Gefäße zugefügt. Das andere diente als Negativkontrolle. Die Transformation erfolgte durch einen Hitzeschock, bei dem die Zellmembran der Bakterien kurzzeitig durchlässig gemacht wurde, wodurch das Plasmid aufgenommen werden konnte. Nach Abkühlung der Proben und Zugabe einer Nährlösung wurden die Bakterien auf verschiedene Nährböden ausplattiert. Die Bakterien mit Plasmid wurde auf einen Nährboden mit dem Antibiotikum Ampicillin und dem Zucker Arabinose gegeben sowie auf einen Nährboden, der ausschließlich Ampicillin enthielt. Arabinose ist ein Zucker, der im Experiment als Aktivator zur Expression des GFP-Gens fungiert. Die Negativkontrolle kam auf einen Nährboden ohne Zusatz von Ampicillin und auf einen mit Ampicillin. Aufgrund der langen Inkubationszeit konnte das eigene Ergebnis nicht mehr betrachtet werden. Deshalb haben wir die Resultate einer Gruppe vom Vortag ausgewertet. Diese entsprachen unseren Erwartungen und es war zu erkennen, dass die Bakterien ohne Plasmid auf einem Nährboden mit Ampicillin nicht wachsen konnten, auf einem Boden ohne Zusätze hingegen schon. Die Bakterien mit Plasmid wuchsen auf dem Nährboden mit Ampicillin durch eine Ampicillinresistenz, welche auf dem Plasmid codiert war, und die auf dem Nährboden mit Ampicillin und Arabinose fingen aufgrund der Anwesenheit des Aktivators unter UV-Licht an zu leuchten.
Vielen Dank an das Team des Gläsernen Labors für den lehrreichen Workshop!
Pascal Gardt, Klasse 13